Fondation Internationale Léon MBA
Faculté Denis Diderot Paris 7 (site Xavier Bichat)
Département de Santé Tropicale
16, rue Henri Huchard - 75018 Paris
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Institut de Médecine et d'Epidémiologie Appliquée (IMEA)
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| Projet soutenu en 2004 N° 2 (sur 5) |
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Evolution des mutations associés à la résistance à la sulfadoxine-pyriméthamine en Afrique : origine unique ou apparition récurrente des allèles Pfdhfr triples mutants et dhps doubles mutants ? Responsable du projet : Djimdé Abdoulaye Chef de l'Unité d'Epidémiologie Moléculaire et de Chimiorésistance MRTC/DEAP/FMPOS, Université de Bamako - BP 1805 Bamako, Mali - adjimde@mrtcbko.org |
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Section budgétaire : 5820DJI90 Rappel du contexte et des objectifs scientifiques L'efficacité de la sulfadoxine-pyriméthamine (SP) comme médicament antipaludique est compromise depuis l'apparition et la propagation de Plasmodium falciparum résistant à la pyriméthamine. Malgré cela, la SP reste le seul médicament recommandable pour le traitement préventif intermittent contre le paludisme pour les femmes enceintes en Afrique sub-saharienne. De plus, la SP est utilisée dans les combinaisons thérapeutiques à base d'artémisine comme traitement au paludisme non compliqué en Afrique. La résistance à la pyriméthamine est liée à l'accumulation de mutations au niveau des codons 51, 59, 108 et 164 du gène Pfdhfr chez le parasite. La présence de l'allèle triple mutant (N51I+C59R+S108N) confère un haut niveau de résistance à la pyriméthamine in vitro et augmente le risque d'échec thérapeutique à la SP. Malgré les avancées scientifiques dans ce domaine, une question subsiste : la propagation de la résistance de P. falciparum à la pyriméthamine aurait–elle une origine unique, ce qui permettrait d'envisager des stratégies limitant son expansion ou serait-elle due à l'apparition récurrente de l'allèle triple mutant, ce qui imposerait de limiter son usage ? Grâce à l'étude de marqueurs polymorphes de type microsatellite qui flanquent le gène Pfdhfr, des études menées en Afrique du Sud, en Tanzanie (Roper 2003) et, plus récemment, au Sénégal (Ndiaye 2006) suggèrent que les allèles Pfdhfr triple mutants ont une origine commune. Une étude complémentaire montre que l'allèle Pfdhfr triple mutant retrouvé en Afrique est originaire d'Asie (Roper 2004). Ces données suggèrent que la migration d'un allèle mutant ancestral, plutôt que l'apparition récurrente de nouvelles mutations, dirige la propagation de la résistance à la pyriméthamine. Cependant, une étude récente remet en question ce modèle. En effet, McCollum et ses collaborateurs (2006) suggèrent que l'allèle Pfdhfr triple mutant aurait une origine multiple à partir des isolats récoltés dans une zone de transmission intense du paludisme au Kenya. Ces travaux ont été menés dans des zones géographiques circonscrites en Afrique et sur un nombre limité de parasites collectés chez des patients impaludés (isolats). C'est dans ce contexte que nous souhaitons comparer les différents haplotypes Pfdhfr des isolats présents dans différents pays d'Afrique sub-saharienne où l'endémicité est différente. Pour cela, nous avons procédé à un typage moléculaire des séquences polymorphes de types microsatellites flanquant le gène Pfdhfr (figure 1). Figure 1. Marqueurs microsatellites flanquants le gène Pfdhfr. 
Objectifs scientifiques annoncés dans le projet : a. Mise au point d'une technique de PCR "multiplex" permettant l'amplification simultanée des quatre séquences microsatellites étudiées. Les tailles de ces séquences amplifiées seront déterminées par analyse de fragments sur séquenceur automatique. b. Analyser la diversité génétique des allèles Pfdhfr associés à la résistance à la SP dans un ensemble de régions d'Afrique sub-saharienne ayant une endémicité variable. c. Examiner si l'évolution de la résistance à la SP est due au flux d'un allèle de résistance unique pour Pfdhfr ou à une sélection de mutants de manière aléatoire en plusieurs occasions indépendantes. Résultats Une PCR "multiplex" permettant l'amplification de quatre séquences microsatellites simultanément a été mise au point et est fonctionnelle (figure 2A et B). L'utilisation d'amorces fluorescentes permet de marquer les fragments contenant chaque microsatellite. La taille des microsatellites est déterminée par électrophorèse capillaire sur séquenceur automatique haut débit ABI PRISM 3100 et analysée grâce au logiciel GENESCAN (figure 2C). La combinaison des allèles situés au niveau des quatre loci microsatellites permet de définir un haplotype S s'il est associé à un allèle Pfdhfr sauvage et un haplotype R s'il est associé à un allèles Pfdhfr triple mutant. Figure 2. A et B. Migration sur gel d'agarose des amplifiats des quatre microsatellites en positon -0.1 kb (a), +0.5 kb (b), +1.5 kb (c) et -3.87 kb (d) obtenus par PCR "multiplex" (A) ou par simple PCR (B) des isolats monoclonaux triple mutants Pfdhfr (1, 2, 3, 4 et 5). C. Profil d'analyses d'un amplifiat obtenu par PCR "multiplex" d'un isolat monoclonal triple mutant Pfdhfr. Pics rouges : marqueur de taille ; pics vert et bleu : fragments microsatellites. 
Les allèles Pfdhfr triple mutants et sauvages de 441 isolats de P. falciparum provenant de 11 pays d'Afrique sub-saharienne (Bénin, Cameroun, Congo, Comores, Guinée, Côte d'Ivoire, Gabon, Sénégal, Mali, Ghana et Ouganda) ont été déterminés par une méthode d'amplification de l'ADN suivie d'une digestion enzymatique. Le génotypage des quatre marqueurs microsatellite situés de part et d'autre du gène Pfdhfr a été effectué grâce à la PCR multiplex et a permis de mettre en évidence 280 isolats monoclonaux parmi notre échantillon de départ. A partir des 280 isolats monoclonaux, plusieurs allèles ont été mis en évidence au niveau des quatre microsatellites étudiés : 16 allèles au locus -3,87 kb (184-224 pb), 16 allèles au locus -0.1 kb (127-165 pb), 11 allèles au locus +0.5 kb (85-111 pb) et enfin trois allelès au locus +1.5 kb (196-204 pb). La reconstruction des haplotypes Pfdhfr (figure 3) a permis de mettre en évidence une grande diversité haplotypique au niveau des isolats portant l'allèle Pfdhfr sauvage. En effet, 73 haplotypes S ont été identifiés pour les 75 isolats sauvages. Par contre, une diversité haplotypique plus réduite a été trouvée dans le groupe des isolats triple mutants. Nous avons mis en évidence 18 haplotypes R pour les 205 isolats triple mutants. De plus, 85 % des isolats triple mutants partageaient le même haplotype avec l'allèle 194 pb au locus -3.87 kb, l'allèle 147 pb au locus -0.1 kb, l'allèle 105 pb au locus +0.5 kb et l'allèle 202 pb au locus +1.48 kb. Parmi les haplotypes R restant, un seul isolat, originaire de Côte d'Ivoire, présentait une différence au niveau des quatre loci microsatellites (192 pb/151 pb/103 pb/204 pb). Aussi, aucun des deux groupes (R ou S) ne partageait le même haplotype. Enfin, l'haplotype d'un isolat thaïlandais portant l'allèle triple mutant était identique à l'haplotype prédominant dans notre échantillon d'isolat africain. Ces résultats confirment l'hypothèse que les allèles Pfdhfr triple mutants présent en Afrique et en Asie ont une origine commune. Cependant, la présence d'un haplotype R présentant un profil différent dans notre échantillon suggère une seconde origine de l'allèle Pfdhfr triple mutant. L'analyse de marqueurs microsatellites plus proche du gène Pfdhfr sur cet isolat permettra de vérifier cette hypothèse. Figure 3. Polymorphisme des haplotypes Pfdhfr sauvages et mutants : 85% des triples mutants portent le jeu d'allèles 194/147/105/202, qui est l'empreinte génétique de la souche asiatique importée en Afrique. 
Article publié : A shared asian origin of the triple-mutant dhfr allele in Plasmodium falciparum from sites across Africa. O. Maïga, A. Djimdé, .V. Hubert, E. Renard, A. Aubouy, F. Kironde, B. Nsimba, K. Koram, O. Doumbo, J. Le Bras and J. Clain. Journal of Infectious Diseases, 2007 : 196 (1 July) (format pdf; 695 Ko). |
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