Réseau interactif des centres d'expertise
de la chimiosensibilité du paludisme
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Compte-rendu de la réunion Atelier Pal+ du 15 octobre 2003,
IMEA, Paris, France.
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- Coordonnateurs du réseau : Daniel Parzy (IMTSSA) et Léonardo K. Basco (IRD).
- Membres présents du réseau :
F. Ariey (Madagascar), L.K. Basco (Cameroun), P. Brasseur (Sénégal, Casamance), A.H. Beavogui (Mali), J.B. Duchemin (Niger), S. Houze (France), R. Jambou (Sénégal), J. Le Bras (France), D. Menard (République Centrafricaine), J.B. Ouedraogo (Burkina Faso), D. Parzy (France), L. Penali (Côte d'Ivoire), B. Pradines (France), M. Randrianarivelojosia (Madagascar).
- Membre représentant Pal+ : F. Agid.
- Observateur OMS : P. Ringwald.
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(I) Ouverture de la réunion par F. Agid
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(II) Synthèse de la réunion de travail d'Anglet (P. Pradines)
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Un certain nombre de paramètres ont déjà été adoptés par l'ensemble des membres du réseau.
Quelques points sont restés en discussion lors de la réunion de travail d'Anglet :
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Lors de la réalisation du test :
- choix du sérum humain ou de l'albumax,
- choix de l'incubateur à 5% de CO2 ou de la cloche à bougie,
- contrôle de qualité,
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Médicaments à tester :
- choix des molécules en systématique (problème de l'Asie),
- choix des gammes à uniformiser,
- problème d'obtention de la luméfantrine,
- stabilité et conservation des plaques,
- contrôle de qualité.
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Exploitations des résultats :
- choix du logiciel d'interprétation des résultats.
Des réponses à ces différents points seront apportées dans les présentations et dans les discussions.
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(III) Présentation des résultats des travaux de L. Basco
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Effet du délai de mise en culture sur la viabilité des parasites conservés à +4°C sur EDTA.
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Effet du délai de mise en culture sur la sensibilité des isolats maintenus à +4°C :
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Utilisation du sérum versus albumax.
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(IV) Présentation des résultats préliminaires de l'étude sur le contrôle des plaques de chimiosensibilité de l'OMS (B. Pradines)
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(V) Présentation des résultats sur le mode de distribution et de conservation des plaques de chimiosensibilité (S. Houzé)
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(VI) Tests substitutifs à la méthode isotopique (réflexions sur le kit pLDH)
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(VII) Synthèse des discussions :
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Le test de chimiosensibilité in vitro est un outil complémentaire indispensable prédictif de la résistance aux antipaludiques. Le réseau Pal+ représente un système d'alerte. L'expansion de ce réseau est envisagée : tout d'abord, il sera complété par d'autres équipes francophones (IP Cayenne, IP Cambodge) puis il sera ouvert à des équipes anglophones.
Réflexions sur la standardisation du test à mettre en application dès janvier 2004 :
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Critères de prélèvements :
- Sang veineux sur EDTA (une étude comparant la viabilité des parasites prélevés sur EDTA et sur CPDA sera réalisée par L. Basco).
- Le délai de conservation des prélèvements à +4°C impérativement avant la réalisation du test doit être le plus court possible.
- Détections systématiques des antipaludiques dans les urines par la méthode de Saker-Solomons (détection de la chloroquine, de la quinine, de la méfloquine, de l'atovaquone, du proguanil et de la pyriméthamine). Les plasmas peuvent être dosés rétrospectivement par HPLC.
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Réalisation du test :
- Parasitémie : entre 0,1 et 0,5 %,
- Hématocrite : 1,5 %,
- Volume de suspension d'hématies parasitées par puits : 200 µl,
- Température d'incubation : 37°C,
- Temps d'incubation : 42 h,
- Gaz médicaux (incubateur CO2 ou jarre à bougie) : il a été décidé que toutes les équipes s'équiperont d'un incubateur CO2 et réaliseront les tests de chimiosensibilité à 5 % de CO2.
- Sérum humain AbCys à 10 % (lot n° S02909S4190) jusqu'au 15 octobre 2004. A définir : le choix entre sérum humain AbCys ou albumax (lot n° 261 262 et 275 640) pendant cette période (comparaison des CI50 respectives à réaliser par chacun des centres). Chaque centre prendra directement contact avec Nathalie Denis (ndenis@abcysonline.com) pour réserver et voir les modalités de commande et de transport du sérum.
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Médicaments à tester :
- Systématiquement pour l'Afrique : chloroquine, monodéséthylamodiaquine, dihydro-artémisinine et luméfantrine.
- Toutes ces molécules seront commandées par A. Keundjian (laboratoire de pharmacologie, IMTSSA) au nom de l'ensemble du réseau et redistribuées à chacun des membres. Elle s'est d'ores et déjà mis en rapport avec Novartis pour l'acquisition de luméfantrine.
- Solubilisation :
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dans l'eau pour la chloroquine et la monodéséthylamodiaquine,
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dans le méthanol pour la dihydroartémisinine
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dans l'éthanol ou éthanol + tween 20 + acide linoléique pour la luméfantrine (des essais comparatifs de solubilisation dans les 2 types de solvants et des essais de stabilité des plaques seront réalisés par L. Basco).
- Conservation des plaques : au moins un an à température ambiante pour la chloroquine et la monodéséthylamodiaquine, 9 semaines à température ambiante pour la dihydroartémisinine et reste à définir pour la luméfantrine.
- Choix des concentrations : 9 concentrations seront réalisées pour chaque molécule :
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chloroquine
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12,5 / 25 / 50 / 100 / 200 / 400 / 800 / 1600 / 3200 nM
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monodéséthyamodiaquine
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7,5 / 15 / 30 / 60 / 120 / 240 / 480 / 960 / 1920 nM
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|---|
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luméfantrine
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1,25 / 2,5 / 5 / 10 / 20 / 40 / 80 / 160 / 320 nM
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|---|
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dihydroartémisinine
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0,25 / 0,5 / 1 / 2 / 4 / 8 / 16 / 32 / 64 nM
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Modèle de plaque :
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chloroquine
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monodéséthy-
amodiaquine
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luméfantrine
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dihydro-
artémisinine
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|---|
| 0 | 0 | 0 |
0 | 0 | 0 |
0 | 0 | 0 |
0 | 0 | 0 |
| 12,5 | 12,5 | 25 |
7,5 | 7,5 | 15 |
1,25 | 1,25 | 2,5 |
0,25 | 0,25 | 0,5 |
| 25 | 50 | 50 |
15 | 30 | 30 |
2,5 | 5 | 5 |
0,5 | 1 | 1 |
| 100 | 100 | 100 |
60 | 60 | 60 |
10 | 10 | 10 |
2 | 2 | 2 |
| 200 | 200 | 200 |
120 | 120 | 120 |
20 | 20 | 20 |
4 | 4 | 4 |
| 400 | 400 | 400 |
240 | 240 | 240 |
40 | 40 | 40 |
8 | 8 | 8 |
| 800 | 800 | 1600 |
480 | 480 | 960 |
80 | 80 | 160 |
16 | 16 | 32 |
| 1600 | 3200 | 3200 |
960 | 1920 | 1920 |
160 | 320 | 320 |
32 | 64 | 64 |
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Exploitation des résultats :
- Témoin : doit être > 1000 cpms,
- Bruit de fond : plateau sur les 3 dernières concentrations,
- Rapport témoin / bruit de fond : doit être > 5,
- Modèle mathématique : R. Jambou réalisera sur Excel un logiciel qui sera utilisé par chacun des membres du réseau dès janvier 2004. Pour fin novembre, chaque laboratoire membre doit rédiger un cahier des charges, à adresser à R. Jambou, de même qu'une copie de leur logiciel actuellement utilisé.
- La validation d'un résultat ne peut se faire qu'après l'examen visuel de la courbe.
- A partir de 2004, on ne parlera plus de seuil de résistance (sauf éventuellement pour la chloroquine). Mais de toute façon, avec les nouveaux critères de réalisation des tests, même ce seuil ne sera plus valide. C'est la fluctuation des moyennes des CI50 qui sera comparée d'année en année et entre les différentes équipes du réseaux.
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Contrôle de qualité :
- Validation des plaques sur 2 clones de référence (3D7 et W2) deux fois par an. Les clones seront soit envoyés par l'IMTSSA à chacun des membres, soit distribués lors d'une réunion du réseau.
Contrôle systématique et validation de chacun des lots par chevauchement de l'ancien et du nouveau lot et analyse par 5 isolats.
- L'IMTSSA se chargera :
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de préparer les solutions d'antipaludiques et les plaques prêtes à l'emploi avec les 4 molécules ;
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de les envoyer régulièrement en fonction de la consommation moyenne de chacun (durée de vie limitée des molécules sur la plaque) ;
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de réaliser les dosages sanguins des 4 molécules (voir les
modalités de prélèvement
pour dosage plasmatique des antipaludiques).
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de fournir les emballages et les contenants pour envoi.
- En 2004, les cinq centres participants à la conférence téléphonique d'octobre 2004 (Antananarivo, Bangui, Dakar, Marseille, Paris) ont mis en oeuvre la méthodologie consensuelle pour les 4 molécules retenues dans le cadre du réseau : monodéséthylamodiaquine, chloroquine, luméfantrine, dihydroartémisinine.
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| Les conditions résumées sont : |
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1) Critères de prélèvements :
- Sang veineux sur EDTA,
- Délai de conservation des prélèvements à +4°C le plus court possible.
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2) Réalisation du test :
- Parasitémie : entre 0,1 et 0,5 %,
- Hématocrite : 1,5 %,
- Volume de suspension d'hématies parasitées par puits : 200 µl,
- Température d'incubation : 37°C,
- Temps d'incubation : 42 h,
- Atmosphère : 5 % de CO2,
- Sérum humain AbCys à 10 % (lot n°S02909S4190).
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