Institut de Médecine et d'Epidémiologie Appliquée (IMEA) Fondation Internationale Léon MBA Faculté Denis Diderot Paris 7 (site Xavier Bichat) Département de Santé Tropicale 16, rue Henri Huchard - 75018 Paris imea@univ-paris-diderot.fr  -  Tel : 33 - (0)1 - 57 - 27 - 78 - 12

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Le site ANRS Sénégal : La recherche virologique

Coordination Sud : Dr. I. Ndoye Coordination Nord : Pr. P-M. Girard

Le Site ANRS Sénégal Introduction Le site ANRS de recherche sur le Sida du Sénégal entre maintenant dans sa 10ème année, cette durée de la collaboration illustrant la qualité du partenariat établi par toutes les équipes du Sénégal et de la France. Les grandes orientations du site sont restées les mêmes avec en particulier la continuité des travaux sur la diversité génétique des VIH et ses conséquences et sur l'évaluation de l'initiative sénégalaise d'accès aux antirétroviraux selon une approche multidisciplinaire. L'effet structurant de ces projets s'est maintenu avec un effort important de l'ANRS qui après le renforcement du laboratoire du Pr. S. Mboup (PCR en temps réel et séquenceur), va se traduire par la construction en partenariat avec l'Union Européenne d'un centre de recherche clinique et de prise en charge des personnes vivant avec le VIH au sein du CHU de Fann. La formation s'est également maintenue à un haut niveau, qu'elle soit pratique ou académique (6 DEA, 3 thèses). Les journées scientifiques du site seront l'occasion de faire le point sur tous ces projets et de définir ceux à venir. L'année 2004 sera marquée par la présence du Président de l'IRD et du Directeur de l'Institut Pasteur ce qui illustre l'engagement auprès de l'ANRS des principales institutions du Nord impliquées. Résumé des activités Le site ANRS de recherche sur le sida du Sénégal (projet SIDAK) a été initié en 1995 suite à la mission d'identification effectuée par Christian Marchal (MAE) et Eric Delaporte. Les principes qui avaient mené à la création de ce site de recherche étaient la mise en place de projets de recherche ayant pour finalité d'optimiser la prévention et la prise en charge du sida au Sénégal et plus généralement en Afrique. Ces projets se devaient d'avoir une composante formation importante et de jouer un rôle structurant, en permettant en particulier le renforcement des structures nationales sénégalaises. Depuis sa création, les principaux partenaires institutionnels sont, au Sénégal, les CHU de Dakar, (Fann et Le Dantec), le centre de Traitement Ambulatoire Croix Rouge (OPALS), l'Hôpital Principal, l'Institut Pasteur et l'Institut d'Hygiène Sociale, le Centre Paul Corréa et le Comité National de Lutte contre le Sida. Le coordinateur en est toujours le Docteur Ibra Ndoye depuis sa création, et au Nord, Eric Delaporte a remplacé JP Coulaud en 2002. Au Nord, les principaux partenaires sont l'IRD (UMR 145), l'IMEA, l'INSERM U88, l'Institut Pasteur, l'Université d'Aix-Marseille. sénégalaises. La recherche virologique sur le VIH Introduction Elle est menée par le laboratoire du Professeur S. Mboup (CHU Le Dantec) en collaboration étroite avec l'UMR 145 (exUR36 ) de l'IRD à Montpellier. L'axe de recherche principal porte sur la diversité génétique du VIH et ses implications. Dans ce domaine, les travaux menés ont acquis une réputation internationale, comme le témoignent les très nombreuses publications et leur valorisation par l'OMS. Ces travaux ont été menés dans le cadre du projet ANRS 1225 financé pour 3 ans maintenant terminé. Mais la dynamique issue de ce projet fait que les études se poursuivent en particulier dans des pays durement touchés par la crise et/ou la guerre comme la RDC. Dans sa continuité, l'observatoire de l'émergence des résistances aux ARV (ANRS 1257) impliquant le Sénégal, le Cameroun et le Burkina Faso, se fait en collaboration avec les mêmes équipes, Hervé Fleury ayant la responsabilité des études menées en Côte d'Ivoire, en Asie et en Inde. Le laboratoire du Pr. S. Mboup intervient également en soutien direct à la recherche clinique et pour l'évaluation de stratégies alternatives du suivi des patients sous ARV (PCR en temps réel) dans le cadre de l'initiative multicentrique de l'ANRS, et mesure du taux de CD4 par méthode Dynabeads (projet ANRS 1212 multicentrique). Ce laboratoire possède toutes les infrastructures lui permettant d'effectuer la biologie moléculaire grâce à l'aide initiale de l'UE et maintenant de l'ANRS avec en particulier l'achat d'un séquenceur actuellement totalement opérationnel. Projet ANRS 1225 : Dynamique de la diversité génétique du virus VIH en Afrique. Ce projet a été mené en partenariat entre le CHU Le Dantec (NC Toure-Kane) et l'IRD UR 36 (M.Peeters) en collaboration avec le réseau africain de recherche sur le Sida que coordonne le Professeur S. Mboup. Ses objectifs étaient : - Etudier la dynamique des sous-types viraux du VIH-1 impliqués dans la pandémie en Afrique de l'Ouest et Centrale. - Etudier les caractéristiques moléculaires des variants majoritaires et émergents. Pour se faire, la méthode était basée sur les enquêtes épidémiologiques de surveillance sentinelle. Les analyses étaient effectuées par les biologistes des pays concernés dans un des 2 laboratoires de référence : à Dakar (HMA) et/ou à Montpellier (HMA et séquençage). La composante formation de ce projet était un élément majeur, que cela ait été sous forme de stages ou de formations académiques (thèse et DEA). Ce projet a permis la caractérisation de nouvelles souches (sous-type K, sous-type A29 et F2) et de nouveaux CRF's (CRF06-cpx et CFR11-cpx). La répartition relative des différentes souches a été précisée dans de nombreux pays, avec en particulier, la part grandissante des virus recombinants et la mise en évidence de phénomènes de recombinaison entre les souches M et O. Ce projet a, par ailleurs, contribué à préciser l'origine du VIH, et à réfuter l'hypothèse d'une contamination liée à la vaccination de masse en Afrique contre la poliomyélite. Concernant les implications de cette diversité génétique, nos études ont porté, entre autres, sur l'impact clinique, le diagnostic et la résistance aux ARV en montrant le polymorphysme naturel des souches non B au niveau des gènes de la protease et de la reverse transcriptase. Depuis octobre 2002, deux nouvelles thèses ont été soutenues sur ces recherches : Mamadou Saidou (Niger),Université de Dakar et Claire Mulanga (RDC), Université ParisVI. Projet ANRS 1257 : Observatoire de la résistance du VIH-1 aux ARV au Sénégal, Cameroun et Burkina Faso. Dans la continuité du projet précédent ce programme associe le CHU Le Dantec, l'UR 36 ainsi que le Centre Muraz et le projet PRESICA de Yaoundé au Cameroun. L'objectif est d'étudier la sensibilité génotypique des souches circulantes dans les infections VIH récentes et d'étudier la résistance aux ARV chez les patients traités. La population étudiée concerne les patients naifs, les cohortes thérapeutiques (soutien à l'accès aux ARV) et les programmes de prévention de la transmission de la mère à l'enfant. Ce projet est opérationnel dans les trois sites. Les résultats seront présentés lors des journées scientifiques. Des analyses sont encore en cours, en particulier pour les populations naïves de tout traitement. Sur un plan académique Charles Kouanfack (Cameroun) et Diane Valea (Burkina Faso) ont réalisé leur mémoire de DEA sur ce sujet et Laurence Vergne a soutenu sa thèse en 2003. De façon satellite à ce projet et à la demande de certains partenaires ayant participés au programme ANRS sur la diversité génétique, des études ont été menées en particulier en RDC. Perspectives : Le bilan scientifique de ces projets sur la diversité génétique du VIH suffit à montrer à quel point il était important que de telles études soient faites. Ces résultats sont une référence internationale. Ces études ont, par ailleurs, eu un rôle formateur et structurant qui ne se limite pas au seul Sénégal. Les conséquences de cette diversité génétique, son évolution constante, font qu'à notre avis, l'étude de la dynamique de distribution des souches VIH-1 en corrélation avec l'épidémie doit se poursuivre. Les résultats qui seront présentés sur la RDC (qui ont fait l'objet d'une présentation orale lors de la dernière CROI) sont là pour en témoigner. L'étude de la résistance aux ARV dans le contexte de la diversité génétique et de l'introduction des ARV est plus que jamais d'actualité. L'importance des phénomènes de recombinaisons génétiques observés lors de ces études d'épidémiologie moléculaire suggère que les phénomènes de super-infection sont loin d'être rares. Afin de mieux les étudier un nouveau projet vient d'être validé par l'ANRS qui sera coordonné au Nord par M.Peeters et au Sud par S.Mboup, Halimatou Diop en fera son sujet de thèse : Etude de la prévalence des doubles infections et l'incidence des super-infections avec un sous types/CRT différent dans 2 cohortes de patients en Afrique (Sénégal, Cameroun). Les analyses phylogénétiques de nombreuses souches d'origine géographique diverse ont permis d'établir une classification des VIH-1 en 3 groupes (M, N et O), 9 sous-types (A à D, F à H, J et K) et 15 CRFs (forme de recombinant circulant). A côté des CRFs qui jouent un rôle majeur dans l'épidémie globale, de nombreux autres virus recombinants ont été documentés. En Afrique, entre 10% à > 40% des souches VIH-1 pour lesquels 2 ou plusieurs régions différentes du génome ont été caractérisées, appartiennent à un sous-type/CRF différent selon la région étudiée. Les recombinaisons sont le résultat d'infections simultanées par plusieurs variants de VIH. L'existence d'un grand nombre de virus recombinants montre de facto que les co-/super infections sont loin d'être un événement exceptionnel. Cependant, la fréquence réelle des co-/super-infections n'est pas encore connue. De la même faĜon, les conséquences biologiques des recombinaisons et des super-infections ne sont pas élucidées. L'objectif principal de cette étude est de documenter la prévalence des doubles infections et l'incidence des super-infections par 2 sous-types/CRFs différents dans 2 cohortes de patients vivants avec le VIH en Afrique (Sénégal et Cameroun) et suivis depuis 1996/1997. Habituellement les doubles infections sont identifiées par clonage et séquençage de multiples clones pour chaque individu à un moment précis. L'identification des super-infections sur un grand nombre d'échantillons nécessite des outils simples et peu coûteux en temps. La technique HMA autologue suivie de clonage et de séquençage, des PCRs sous-type/CRF spécifiques, ou des tests d'hybridations avec des sondes sous-type/CRF spécifiques sont des alternatives. Dans une étude antérieure nous avons utilisé l'HMA-autologue sur gel polyacrylamide pour identifier des co-infections dans une cohorte de prostituées à Bobo-Dioulasso, mais la faible prévalence des co-infections (1.2%) comparée à 10% dans une population de donneurs de sang en Afrique de l'Est par la technique MHA (Multi-region Hybrydization Assay, essai d'hybridation multi-région), suggère que l'approche HMA autologue n'est pas assez sensible. Nous proposons d'optimaliser la technique HMA autologue par électrophorèse sur gel en utilisant un séquenceur capillaire, et de développer un test MHA capable de détecter simultanément les doubles infections, recombinaisons et identification des sous-types/CRF impliqués dans les doubles infections. Cette dernière technique a déjà été validée pour discriminer les sous-types A, C et D en Afrique de l'Est avec une sensibilité et une spécificité élevée pour l'identification des sous-types, doubles infections et virus recombinants. Nous proposons d'étendre cette approche aux sous-types A, C, D, F, G, H, CRF02-AG et CRF06-cpx, prédominants en Afrique de l'Ouest et de Centre Ouest. La sensibilité et la spécificité des techniques HMA et MHA pour la détection des doubles infections seront évaluées sur un panel de souches de référence et en mélangeant 2 populations virales en différentes proportions. La comparaison de ces techniques permettra d'identifier une stratégie/algorithme pour le criblage d'un large nombre d'échantillons et d'estimer leurs limites, tenant compte des différents impératifs techniques (différence d'équipement des laboratoires au Sud et au Nord). Selon l'algorithme défini, la prévalence des co-infections et l'incidence des super-infections par deux sous-types/CRFs sera déterminée dans deux cohortes de patients vivants avec le VIH au Cameroun et au Sénégal. La technique MHA sera également adaptée pour l'ARN viral plasmatique, afin de quantifier chaque variant impliqué dans une double infection et d'étudier ainsi la dynamique entre les populations virales pendant l'infection VIH. Le suivi longitudinal permettra d'identifier la fréquence et la vitesse à laquelle les virus recombinants se forment. Pour l'étude proposée, nous disposons déjà du matériel biologique (prélèvements séquentiels stockés au moins 2 fois par an) ainsi que des données cliniques, immunologiques et virologiques sur l'évolution de l'infection chez chaque personne incluse dans ces 2 cohortes (n=500). En perspective, cette étude permettra éventuellement en fonction de la prévalence des co-/super-infections dans ces deux cohortes, d'étudier les facteurs cliniques, virologiques et immunologiques associés à ces super-infections et de comparer l'évolution de l'infection VIH chez des patients co-/super-infectés versus mono-infectés.

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